Гибридизация ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот — соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу. При полной комплементарности объединение происходит легко и быстро, а в случае частичной некомплементарности слияние цепочек замедляется, что позволяет оценить степень комплементарности. Возможна гибридизация ДНК-ДНК и ДНК-РНК.

Протокол эксперимента

1. Двухцепочечную ДНК разогревают в соответствующем буфере. Из-за изменения внешних условий, водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями становятся термодинамически невыгодными и цепочки расходятся.
2. Препарат денатурированных ДНК смешивают с другой денатурированной ДНК.
3. Препараты медленно охлаждают, при этом одноцепочечные ДНК отжигаются друг на друга (образуются водородные связи между комплементарными основаниями), при этом образуется «гибридная» молекула ДНК.

Анализ скорости отжига одноцепочечных ДНК позволяет оценивать сходства и различия в последовательностях ДНК между видами или особями одного вида.

Вычисление температуры плавления ДНК

Вторичная структура ДНК играет важную роль в биологии, генетической диагностики и других методов молекулярной биологии и нанотехнологии. Поэтому, точное определение температуры плавления ДНК или РНК молекул играет самую главную роль во всех молекулярно-биологических методах, например, как подбор проб или олигонуклеотидов для микрочипов или для подбора ПЦР праймеров. Существует несколько простых формул вычисления температуры плавления для коротких олигонуклеотидов. Грубое вычисление температуры плавления (T_m) короткого олигонуклеотида (<20 нуклеотидов) проводят по прямому подсчету количества нуклеотидов (G+C - сумма всех гуанинов и цитозинов, L - длина олигонуклеотида):

,^[1]

Усредненная формула подсчета T_m для короткого олигонуклеотида (и для длинных ДНК фрагментов), но с учетом концентрации ионов K⁺ и DMSO:

, ^[2]

Однако, это уравнение не учитывает инициацию связывания при гибридизации олигинуклеотида, не учитывают особенности самой последовательности и концевого эффекта, характерный для олигонуклеотидных дуплексов. Поэтому, данная формула пригодна в большей степени, где последовательность ДНК усредненная и длина дуплексов свыше 40 нуклеотидов.

ДНК термодинамика

Наиболее распространенный метод используемый сегодня для расчета температуры плавления двухцепочечной или одноцепочечной ДНК, основан на двух ступенчатой термодинамической модели. Две комплементарные ДНК молекулы А и В, либо они связаны друг с другом либо свободны в растворе («random coil state»). Обычно считается, что обе молекулы А и В полностью комплементарны, поэтому очевидна их гибридизация, а также разрешены одна или несколько ошибок комплементарности в дуплекс, в том числе допустимы и некомплементарные G-G, G-T и G-A пары (wobble pairs). В случае же только одной молекулу, предполагается упаковка ее в петлевую структуру. Процесс гибридизации в дуплекс описывается формулой:

где А и В разные цепи в растворе («random coil state»), и АВ образованный дуплекс. Данная реакция обратима. Константа равновесия k, для этой реакции определяется как: .

Константа равновесия зависит от концентрации цепей, от температуры, концентрации солей, рН и других компонентов в реакции (например, глицерин или DMSO). Константа К меняется в ответ на изменение концентрации одной или обоих цепей ([At] и/или [Bt]), тогда вся система отвечает на изменения и тогда индивидуальные концентрации [A], [B] и [AB] тоже изменятся. Например, если в системе больше цепи А, то концентрация [AB] увеличится. Предположим, константа равновесия равна 1.81x10⁶ и концентрация цепей [At] = [Bt] = 10^-5M:

Подставляем компоненты в формулы для вычисления k:

После перестановки получаем:

где .

Например, подставить в эту формулу [AB] = 7.91x10^-6M тогда концентрацию цепей составит [A] = [B] = 2.09x10^-6M. То есть только 79% [At] цепей будет связаны в дуплекс [AB].

Возможно ли определить константы равновесия при изменении температуры? Это подводит нас к пониманию важных термодинамическим параметрам как свободной энергии (dG), энтальпия (dH) и энтропия (dS). Изменения свободной энергии, энтальпия и энтропия происходят при переходе от «температуре Т гибридизации» к беспорядочному, случайному состоянию. Эти отношения определяются формулой dG = dH – TdS, (для концентрации цепей [A] = [B] = [AB] = 1M), тогда идеальная формула для вычисления свободной энергии Гиббса:

где T температура в кельвинах, dH° (cal/mol) и dS° (cal/mol K).

Существует полезное соотношение, связывающее изменение свободной энергии Гиббса в ходе химической реакции с её константой равновесия:

где R – универсальная газовая постоянная (1.987cal/mol K).

Комбинируя обе формулы получаем:

Температура плавления (T_m) определяется при равновесии, когда половину цепей связаны друг с другом и другая половина находится в свободном состоянии, то есть k=1:

Температуру плавления для простой петли рассчитывают как . Для ДНК дуплекса необходимо учитывать концентрацию каждой цепи (в молях, М). Таким образом, если [A] и [B] концентрации молекул А и В, то общая концентрация цепей, C равна их сумме, [A] + [B].

Предполагается, что концентрация обоих цепей одинаковая [A] = [B] = C/2. В таком случае,

где f = 4. Для самокомплементарного олигонуклеотида [A₀] = C и тогда и f = 1. Данная температура плавления определяется только в случае, когда половина молекул связаны друг с другом.

Для самокомплементарного олигонуклеотида, k = 1/[At] поэтому:

Для не комплементарного дуплекса, когда [At] ≥ [Bt], k =1/([At] – [Bt]/2), Tm вычисляют так:

где [At] молярная концентрация преобладающей цепи (как правило ПЦР праймер), а [Вt] молярная концентрация цепи с низкой концентрацией (геномная ДНК).

Вычисление температуры плавления

Термодинамические параметры dG, dH и dS рассчитываются на основе модели ближайших соседей (nearest neighbour). Точная прогнозирования вторичной структуры ДНК при гибридизации с использованием динамических алгоритмов программирования требуется база данных по всем возможным термодинамическим параметрам для каждой комплементарной пары оснований, а также для для всех вариантов при не совпадающих нуклеотидов, для свободных концов, шпилек и петель. Термодинамическая формула вычисления короткого олигонуклеотида основывается на термодинамических параметрах — энтропии dS и энтальпии dH, для каждой из 10 вариантов сочетаний четырех нуклеотидов (Таблица 1). В Таблице 1 представлены термодинамические параметры для ближайших соседей (NN) для пар нуклеотидов при концентрации 1М NaCl.

Для подсчета Tm (°С) осуществляется суммирование всех значений свободной энергии Гиббса для каждой пары с шагом один нуклеотид:

dGобщая = dGначальное + dGсиметрия +∑dG + dGATконец

dG_{теоретическая} = 1.96 + 0 - 2.17 – 1.44 – 1.44 – 1.00 – 1.45 – 1.30 +0.05

dG_{теоретическая} = -5.35 kcal/mol

Аналогично подсчитываются значения энтропии (dH = -43.5 kcal/mol) и энтальпии (dS = -122.5):

Многие ДНК дуплексы имеют конкурирующие однонитевые структуры, и это сдвигает равновесии системы и как результат снижение значения T_m от предсказуемой формулой значения.

Общая формула для вычисления T_m с коррекцией на соль в растворе:

где L - длина олигонуклеотида, R — газовая постоянная (1.987cal/K mol), c — концентрация олигонуклеотида в (обычно 2x10⁻⁷ M), [K⁺] — концентрация ионов калия в молях (обычно 5x10⁻²M).

Одиночная ошибка внутри дуплекса

Модель ближайших соседей для комплементарных нуклеотидных пар может расширен для пары, включающие некомплементарные нуклеотиды. Было показано, что существует тенденция уменьшающая стабильность не комплементарных пар оснований в порядке убывания:

G-C > A-T > G·G > G·T ≥ G·A > T·T ≥ A·A > T·C ≥ A·C ≥ C·C

Гуанидин G является наиболее «неразборчивым» основанием, поскольку он образует сильный пары оснований и с некомплементарными основаниями (G·G, G·T и G·A). С другой стороны, цитозин C является наиболее дискриминационным основанием, поскольку он образует самые стабильные комплементарные пары и неустойчивые пары с некомплементарными основаниями (T·C ≥ A·C ≥ C·C)^[5],^[6].

Ссылки